Isabel de Castilla, hija de Juan II de Castilla y de su segunda mujer, Isabel de Portugal (1428-1496), nació en Madrigal de las Altas Torres (Ávila) el 22 de abril, Jueves Santo, de 1451 en el palacio que hoy ocupa del Monasterio de Nuestra Señora de Gracia.
Dos años después, en Tordesillas, nació su hermano Alfonso. Con anterioridad, y fruto del matrimonio entre Juan II de Castilla y María de Aragón.
A la muerte de su padre en 1454, se retiró con su madre y su hermano Alfonso a la villa de Arévalo, donde vería los ataques de locura de su madre Isabel. Esta es una época de dificultades, incluso económicas, pues aunque su padre había dejado importantes disposiciones testamentarias en favor de su madre, de ella, el rey Enrique IV las incumple reiteradamente. En esta adversidad Isabel se fortaleció con lecturas evangélicas y libros de piedad. También le ayudó su amistad con Santa Beatriz de Silva (1424 - 1491), a la que luego ayudaría en la fundación de la Orden de las Concepcionistas Franciscanas.
En 1461, Isabel y su hermano Alfonso son trasladados a Segovia, lugar donde se emplazaba la Corte, por estar cercano el nacimiento de la hija de los reyes, doña Juana de Castilla.
A pesar de las presiones de los nobles, ella rechazó proclamarse reina mientras Enrique IV estuviera vivo. Por el contrario, consiguió que su hermanastro le otorgase el título de Princesa de Asturias, en una ceremonia que tuvo lugar en los Toros de Guisando, el 19 de septiembre de 1468, conocida como la Concordia de Guisando
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Ya desde los tres años, Isabel había estado comprometida con Fernando, hijo de Juan II de Aragón. Sin embargo, Enrique IV rompió este acuerdo, seis años más tarde, para comprometerla con Carlos, príncipe de Viana. El matrimonio no llegó a consolidarse, por la férrea oposición de Juan II de Aragón. También fueron infructuosos los intentos de Enrique IV por desposar a su hermana Isabel con el rey Alfonso V de Portugal. En 1464, logró reunirlos a ambos en el Monasterio de Guadalupe, pero ella le rechazó, debido a la diferencia de edad entre ambos.
Más tarde, cuando contaba 16 años, Isabel fue comprometida con don Pedro Girón, Maestre de Calatrava y hermano de don Juan Pacheco. (43 años)
Juan II de Aragón, mientras, trató de negociar en secreto con Isabel la boda con su hijo Fernando. Isabel consideró que era el mejor candidato para esposo, pero había un problema legal para contraer matrimonio: eran primos (sus abuelos, Fernando de Antequera y Enrique III, eran hermanos). Necesitaban, por tanto, una bula papal que les exonerara de esta consanguinidad. El Papa, sin embargo, no llegó a firmar este documento.
No obstante, el Papa era proclive a esta unión conyugal, por atraerse a la princesa Isabel, una mujer de marcardo carácter religioso, debido a la amenaza que representaban los árabes a sus Estados Pontificios. Por ese motivo, ordenó a don Rodrigo Borgia dirigirse a España como legado papal para facilitar este enlace.
Los escrúpulos de Isabel para contraer matrimonio sin contar con la autorización papal impedían realizar la ceremonia. Con la connivencia de don Rodrigo Borgia, los novios presentaron una supuesta bula emitida en junio de 1464 por el anterior Papa, Pío II, a favor de Fernando, en el que se le permitía contraer matrimonio con cualquier princesa con la que le uniera un lazo de consanguinidad de hasta tercer grado. Isabel aceptó y se firmaron las capitulaciones matrimoniales de Cervera, el 5 de marzo de 1469.
